液体活检技术在肿瘤病人的诊疗分期，病情监测，个体化治疗，以及后期监测的各个阶段都有广泛的应用。循环肿瘤细胞：（CTC，CirculatingTumorCell）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。肿瘤细胞侵入到原发肿瘤细胞的周围组织中，进入血液和淋巴管系统，形成循环肿瘤细胞CTC，并转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶。CTC技术作为液体活检技术之一，其富集的细胞具有生物活性可以进行体外培养、小鼠建模以及RNA分析，可以作为耐药机制、肿瘤转移的机制探索工具。
来自于上海医院的陆舜教授团队利用微流体技术（新加坡Biolidics公司）从非小细胞肺癌肿瘤患者的恶性胸腔积液胸腔积液中富集肿瘤细胞，通过异种移植肿瘤模型探索耐药机制。
01背景表皮生长因子受体(EGFR)突变或间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合的非小细胞肺癌(NSCLC)患者对特异性酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)表现出显著的反应;然而，10-12个月后，继发突变产生耐药性。研究表明，患者来源的异种移植物对EGFR或ALKTKIs的反应与供者对类似TKI治疗的反应接近。因此，异种移植是研究NSCLC耐药机制的有用工具，但是很难获得第二次或第三次患者来源的活检。理想情况下，非小细胞肺癌患者应该接受原发肿瘤或转移瘤的二次活组织检查，以确定其特定的耐药性特征。然而，实施二次活检往往受到病变或转移的位置、患者是否愿意接受额外的侵袭性手术以及其他因素的限制，所有这些都阻碍了提高靶向治疗的临床效果。该文章中使用从两名非小细胞肺癌患者胸液中分离的患者来源的非小细胞肺癌细胞建立了小鼠异种移植模型，分别研究ALK和EGFR靶向TKIs克唑替尼和奥西替尼的耐药性机制。
02方法采用全外显子组测序(wholeexomesequencing,WES)对患者活检和移植瘤基因型进行检测，并对患者和移植瘤小鼠进行针对性治疗(克唑替尼或奥西替尼)。异种移植小鼠也接受了长时间的治疗，以确定耐药性的发展和/或治疗反应是否与肿瘤大小有关。最后，对患者活检和异种移植瘤的病理进行组织学比较。
——值得一提的是由于经过异种移植，物种对象已经发生了变化，从人变成了小鼠，如何从人类全外探针捕获的数据进行过滤、分析，在该文中其分析方法非常巧妙，值得进行类似课题研究的科研工作者采用。
该文的研究路线图如下所示：
03结果与讨论异种移植瘤的组织学特征和化疗反应与实际病例相似。WES发现异种移植瘤和患者肿瘤的基因型相似（见表一）(EML4-ALK)基因融合(患者/移植瘤:CTCEML4-ALK)和EGFRLR和TM突变(患者/移植瘤:CTCEGFRLR,TM)。在持续克唑替尼或奥西替尼治疗后，WES数据提示获得性ALKEK突变导致CTCEML4-ALK异种移植体对克唑替尼耐药。伴随着EGFRLR和TM突变频率降低，加上BRAFG7V突变和PIK3C2AA86fs移码突变，导致CTCEGFRLR,T对奥西替尼耐药。
表一：患者来源活检和异种移植的全外显子组测序结果
ALK是胰岛素受体超家族的跨膜受体酪氨酸激酶。各种染色体重排导致了NSCLC中具有致癌活性的ALK融合，目前文献报道的有近20种不同的ALK融合蛋白，包括EML4-ALK,在NSCLC中是最常见的ALK融合。ALK融合蛋白的下游信号通路涉及JAK/STAT细胞生存通路和MEK/ERK细胞增殖通路。EML4-ALK融合发生在约2%-5%的NSCLC病例中，其中大部分为腺癌。ALK酪氨酸激酶结构域突变和ALK融合扩增导致大约33%接受TKI治疗的NSCLC患者复发。ALK中的某些SNVs发生在ALK-TKI治疗的应答中，包括对克唑替尼（crizotinib）的LM，对切瑞替尼（ceritinib）的GR和复合ALK突变，以及对阿莱替尼（alectinib）的GR。之前有研究表明ALKEK在体外对克唑替尼（crizotinib）具有耐药性，而我们的全外显子组测序分析显示ALKEK突变发生在克唑替尼耐药的异种移植瘤中。
大约70%的NSCLC患者的肿瘤具有EGFR突变，这些突变对EGFR靶向TKIs敏感，TKIs通过结合EGFR的细胞内结构域抑制下游信号事件。大约50%的EGFR阳性肿瘤患者通过多种机制获得对第一代或第二代TKIs、厄洛替尼（erlotinib）、吉非替尼（gefitinib）和阿法替尼（afatinib）的耐药性，包括EGFR的二次突变，如TM、CS和LF/Y/H和其他信号通路的激活,包括HGF,HGFR,HER2，AXL等。因此，尽管这些一线TKI治疗最初有效，但大约50%的NSCLC患者在开始治疗9-14个月后会产生耐药性。第二代TKI，阿法替尼（afatinib）和达科米替尼（da